Herstellung und biochemische Charakterisierung der Austernpilzlaccase NRC 620 und Bewertung ihrer Effizienz bei der Apfelsaftklärung.

Nach 25 Tagen statischer Inkubation bei 28 °C zeigte die Laccase aus *Pleurotus ostreatus* NRC620 die höchste Aktivität im Pilzkulturmedium. Die optimalen pH- und Temperaturwerte für dieses Enzym lagen bei 3,0 bzw. 70 °C. Nach zweistündiger Inkubation bei 40 °C bzw. 50 °C betrug die Enzymaktivität noch 68,33 % bzw. 59,61 %. Nach zweistündiger Inkubation in Citrat-Phosphat-Puffer (pH 7,0) blieb die Enzymaktivität bei 100 %. Die Zugabe von 10 mM MgSO₄ und CuSO₄ erhöhte die Enzymaktivität um etwa 21 % bzw. 35 %, während NaCl, MnCl₂, KCl und CaCl₂ die Enzymaktivität hemmten. Unter Verwendung von ABTS als Substrat betrugen die kinetischen Parameter (Km und Vmax) der Laccase aus *Pleurotus ostreatus* NRC 620 1,99 mM bzw. 16.217 μmol min−1 L−1. Die enzymatische Behandlung von Apfelsaftproben reduzierte sowohl den pH-Wert als auch die Viskosität signifikant, wobei diese Reduktion mit einer Verlängerung der Lagerzeit korrelierte. Die Laccasebehandlung führte zu einer leichten Abnahme des Gesamtphenolgehalts im Apfelsaft, jedoch wurde keine Reduktion der antioxidativen Aktivität beobachtet.
In den letzten Jahren haben sich Forscher verstärkt mit der Anwendung grüner Biotechnologie in der Lebensmittelindustrie befasst. Laccase zählt zu den nützlichsten Enzymen in diesem Bereich und findet Anwendung in Bereichen wie der Saftverarbeitung, dem Backen, der Weinstabilisierung und der Verbesserung der organoleptischen Eigenschaften von Lebensmitteln.¹Viele höhere Pflanzen und Mikroorganismen scheiden Laccase aus.²Auch Pilze wie Deuteromyceten, Ascomyceten und Basidiomyceten können Laccase produzieren.³Laccase (EC 1.10.3.2) ist eine blaue Oxidase, die molekularen Sauerstoff mithilfe eines Systems aus drei verschiedenen Kupferatomen zu Wasser reduziert und dadurch verschiedene phenolische Verbindungen und aromatische Amine oxidiert. Bei der Herstellung von Frucht- und Gemüsesäften sind enzymatische und nicht-enzymatische Bräunungsprozesse kritische Faktoren.⁴Da diese Substanzen die Farbe, den Geschmack und das Aroma des Saftes negativ beeinflussen, müssen sie entfernt werden.⁵
Äpfel sind weltweit und in der Europäischen Union die am häufigsten konsumierten Früchte. 2019 belegte die Apfelproduktion mit über 87 Millionen Tonnen den dritten Platz weltweit.⁶Äpfel enthalten zahlreiche phenolische Verbindungen, darunter Flavonoide und Phenolsäuren wie Kaffeesäure und Chlorogensäure.⁷Da Apfelsaft üblicherweise in seiner klaren Form konsumiert wird, gehen beim Filtrationsprozess etwa 50 bis 90 % der phenolischen Bestandteile verloren.⁸Heutzutage bevorzugen Verbraucher eher minimal verarbeitete Produkte, wie beispielsweise naturtrüben Apfelsaft mit hohem Polyphenolgehalt. Aufgrund seines hohen Phenolgehalts ist dieser Apfelsaft jedoch besonders anfällig für Verfärbungen und Dunkelfärbung.⁹Zur Reduzierung oder Verhinderung der Dunkelfärbung von Apfelsaft werden verschiedene Technologien eingesetzt, darunter Wärmebehandlungsverfahren wie die Pasteurisierung bei 60–90°C.¹⁰Allerdings, so die Forschung von Sauceda-Gálvez¹¹Die thermische Verarbeitung kann flüchtige Inhaltsstoffe zerstören und die organoleptischen Eigenschaften von Apfelsaft beeinträchtigen. Alternativen zu thermischen Verfahren sind überkritisches Kohlendioxid, ultraviolette Strahlung, Ultraschall, hoher hydrostatischer Druck oder Hochdruckhomogenisierung.¹²Die Effizienz dieser Technologien und die Ausbeute an geeigneten Fruchtsäften hängen von den verwendeten Parametern und den Produkteigenschaften ab. Ihre breite Anwendung wird durch hohe Kosten, negative Auswirkungen auf die Qualität einiger Lebensmittel oder unzureichende Enzymdeaktivierung eingeschränkt.^13,14
Laccase kann zur Stabilisierung und Klärung von Fruchtsäften verwendet werden.¹⁵Gökmen et al.¹⁶Die Verwendung von Laccase zur Klärung von Fruchtsäften wird empfohlen, da sie phenolische Verbindungen effektiv entfernt, indem sie diese in Polymere oder Oligomere umwandelt, die sich leicht durch Ultrafiltrationsmembranen entfernen lassen. Dadurch behält Apfelsaft bis zu sechs Wochen lang bei 50 °C eine stabile Farbe und Klarheit. Gereinigte Laccase aus *Trichoderma* wurde auf Aluminiumoxidkügelchen immobilisiert und zur selektiven Entfernung von Fehlaromen eingesetzt, die durch mikrobielle Kontamination von Apfelsaft verursacht werden.¹⁷
Etwa 80-90% der flüchtigen Bestandteile von Apfelsaft sind Ester und Aldehyde, die dem Saft ein einzigartiges Aroma verleihen.¹⁸Laccase aus *Trametes versicolor* wurde auf einem preiswerten Träger aus Naturfasern junger Kokosnussschalen zur Apfelsaftklärung immobilisiert.¹⁹Frühere Studien haben die Stabilisierung von Apfelsaft (Farbe und Trübung) mit enzymfreien oder Immobilisierungsmethoden oder in Kombination mit Ultrafiltration untersucht.^5,19Die Wirkung von Pilzlaccasen auf die physikochemischen Eigenschaften von Apfelsaft während der Lagerung ist jedoch noch unklar. Ziel dieser Studie war es daher, die Veränderungen der physikochemischen Eigenschaften, des Gehalts an phenolischen Verbindungen und der antioxidativen Aktivität von Apfelsaft nach Behandlung mit Pilzlaccasen und zweiwöchiger Kühllagerung experimentell zu untersuchen. Laccasen können phenolische Verbindungen oxidieren und sind daher vielversprechend für den Einsatz in verschiedenen industriellen Prozessen, einschließlich der Saftklärung. In dieser Studie wurden Laccasen aus *Pleurotus ostreatus* NRC 620 untersucht, wobei der Fokus auf den optimalen Bedingungen für ihre Aktivität und Wirksamkeit bei der Saftklärung lag. Obwohl die Forschung zu Austernpilzen (P. ostreatus NRC 620) noch begrenzt ist, wurden in früheren Studien Enzyme aus verschiedenen Pilzquellen, wie z. B. Trametes versicolor und Ganoderma lucidum, untersucht. Ziel dieser Studie war es, das Anwendungspotenzial dieses Enzyms in der Lebensmittelindustrie zu bewerten und seine einzigartigen Eigenschaften, insbesondere den optimalen pH-Wert und die optimale Temperatur, hervorzuheben.
2,2′-Azooxybis(3-ethylbenzothiazolin-6-sulfonsäure) (ABTS) wurde von Sigma-Aldrich (Kanada) bezogen. Alle anderen Reagenzien waren von analytischer Reinheit.
Das Zentrum für mikrobielle Kultursammlungen des Nationalen Forschungszentrums erhielt den bekannten Austernpilzstamm NRC620. Nach der Subkultivierung wurde dieser Stamm auf Kartoffel-Dextrose-Agar-Schrägagar bei 4 °C gelagert. Die Inokulumpräparation erfolgte wie folgt: Zehn Tage altes, voll entwickeltes Myzel wurde auf Kartoffel-Dextrose-Agarplatten inokuliert und bei 28 °C inkubiert. Nach zehn Tagen wurden drei Myzelblöcke mit einem Durchmesser von 12 mm mithilfe eines sterilen Metallstanzers aus dem Agar ausgestanzt und in 250-ml-Erlenmeyerkolben mit Wattestopfen überführt, die 50 ml sterilisiertes Kulturmedium (pH 5,0, wie zuvor von Othman et al. beschrieben) enthielten.²⁰Die Kulturen wurden 18 Tage lang bei 28 °C inkubiert. Anschließend wurden sie durch Whatman-Filterpapier Nr. 1 filtriert, und der resultierende Überstand diente als Enzymquelle.
Die Laccase-Aktivität wurde unter Verwendung von ABTS als Substrat bestimmt. Das Reaktionsgemisch (2 ml) enthielt 500 μl 0,3 mM ABTS (gelöst in 0,1 M Natriumcitratpuffer, pH 4,5) und die benötigte Menge an Enzymprobe, verdünnt mit destilliertem Wasser.^21,22Da Laccase ABTS bei Raumtemperatur (28 °C ± 2) oxidieren kann, wurde die ABTS-Oxidation durch Messung der Zunahme der Absorption bei 420 nm (ε) bestimmt.₄₂₀= 36.000 cm^-1 M ^-1Die Messung erfolgte mit einem Agilent Cary-100 UV-Spektrophotometer. Eine Einheit Laccase-Aktivität war erforderlich, um 1 μmol ABTS pro Minute zu oxidieren. Die Proteinkonzentration wurde mittels Bradford-Methode unter Verwendung von Rinderserumalbumin als internem Standard bestimmt.^23,24
Nach der Gewinnung des Enzyms aus dem Austernpilzstamm NRC 620 wurde seine Aktivität über 25 Tage unter statischen Bedingungen bei 28 °C in verschiedenen Kultivierungsintervallen gemessen.
Um den Einfluss der Temperatur auf die Laccase-Aktivität zu untersuchen, wurden Experimente im Temperaturbereich von 20 bis 90 °C durchgeführt. Vor Zugabe des Enzyms und Start der Reaktion wurden Puffer (0,1 M Natriumcitrat, pH 4,5) und Substrat (ABTS) gemischt und 5 Minuten lang bei verschiedenen Temperaturen inkubiert. Die thermische Stabilität des Enzyms wurde durch Inkubation in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) bei 40, 50, 60 und 70 °C für jeweils 2 Stunden bestimmt. Anschließend wurde die Restaktivität mit dem ABTS-Substrat gemessen.
Der Einfluss des pH-Werts auf die Laccase-Aktivität wurde mit ABTS als Substrat in 0,1 M Citrat-Phosphat-Puffern im pH-Bereich von 2,5 bis 7,0 untersucht. Die Enzymlösung wurde zwei Stunden lang bei 40 °C in 0,1 M Citrat- und Tris-Puffern (pH 3, 4, 6 und 7) inkubiert, um die pH-Stabilität zu bestimmen. Die Restaktivität mit ABTS als Substrat wurde nach der Inkubation berechnet.
Die Laccase wurde 10 min in Natriumphosphatpuffer (0,05 M, pH 7,0) inkubiert, der verschiedene Metallionen (Mg²⁺, Cu²⁺, Co²⁺, Ca²⁺, Zn²⁺, K⁺, Na⁺ und Mn²⁺) in Konzentrationen von 2,5 mM bzw. 10 mM enthielt. Anschließend wurde das Substrat (ABTS) zugegeben, um die Reaktion zu starten, und die relative Aktivität bestimmt.
Die ABTS-Oxidation durch Laccase wurde bei verschiedenen Konzentrationen (0,025–3 mM) bei pH 4,5 gemessen, um die kinetischen Parameter (Vmax und Km) zu bestimmen.^KonstantenDie Michaelis-Menten-Gleichung wurde mithilfe eines Lineweaver-Burk-Diagramms berechnet, das den Kehrwert der Reaktionsgeschwindigkeit als Funktion der Substratkonzentration darstellt. Die kinetischen Konstanten wurden aus dem Lineweaver-Burk-Diagramm mit der Software GraphPad Prism Version 6.01 ermittelt.
Nachdem die Äpfel gründlich mit Leitungswasser gewaschen worden waren, wurden sie halbiert und mit einem vollautomatischen Apfelentsafter vom Typ Braun MP80 (Hersteller: Deutschland) entsaftet. Der Saft wurde durch vier Lagen Mulltuch gefiltert. Der Kontrollgruppe wurden keine Enzyme zugesetzt, während dem frisch gepressten Apfelsaft 2,0 % Laccase (die wirksamste getestete Konzentration) zugesetzt und dieser anschließend zwei Wochen lang bei 4 °C gelagert wurde.
Die titrierbare Säure (TA) und der pH-Wert wurden nach der Methode von Boulton et al. bestimmt.^al.27Der pH-Wert jeder Probe wurde mit einem digitalen pH-Meter (JENWAY 3510 pH-Meter) gemessen. Die titrierbare Säure (TA) wurde anhand der Äpfelsäure nach folgender Formel berechnet.
Dabei bezeichnen V und C das Volumen (ml) bzw. die Konzentration (0,1 mol/l) der in der Titration verwendeten Natriumhydroxidlösung. K ist der Umrechnungskoeffizient der Äpfelsäure (0,067) und W die Masse (g) des Apfelsafts.
Die gesamten löslichen Feststoffe (^TDSDer Natriumgehalt aller Saftproben wurde mit einem PAL-1 Taschenrefraktometer (ATAGO, Tokio, Japan) bestimmt. Nach jeder Messung wurde die optische Linse mit deionisiertem Wasser gespült, und jede Apfelsaftprobe wurde dreimal gemessen. Der Wert für jede Probe wurde als Mittelwert der drei Messungen berechnet. Der Mittelwert ± Standardabweichung für jede Apfelsaftprobe wurde ebenfalls durch Mittelung dieser Ergebnisse berechnet.
Die Viskoelastizität der Apfelsaftproben wurde mit einem Rotationsviskosimeter (RV, Rheotest 2, Deutschland) bestimmt. Die Probe wurde in den Zylinder „S2“ des Viskosimeters gegeben. Die scheinbare Viskosität wurde durch die Steigung der Scherspannungs-Schergeschwindigkeits-Kurve dargestellt, die aus der Scherspannung und den entsprechenden Kurven bei verschiedenen Schergeschwindigkeiten (von 1,00 bis 437,4 s⁻¹) berechnet wurde. Die Formel zur Berechnung der scheinbaren Viskosität lautet wie folgt:
Dabei ist η die scheinbare Viskosität (cP), τ die Scherspannung (dyn/cm²), γ die Schergeschwindigkeit (sec⁻¹) und (τ) wird unter Verwendung des Drehmoments (α) und der Zylinderwerte (Z) mit der folgenden Formel berechnet: τ = Z . α.
Der Bräunungsindex wurde nach der Methode von Meidav ​​et al. bestimmt.^al.29Eine 10-ml-Saftprobe wurde 10 min bei 2750 x g zentrifugiert. 5 ml des Saftüberstands wurden mit 5 ml 95%igem Ethanol vermischt. Die Absorption der Mischung wurde bei 420 nm mit einem Shimadzu-UV-Spektrophotometer (UV-1601 PC) gemessen.
Der Gesamtphenolgehalt (TPC) wurde kolorimetrisch mit dem Folin-Ciocalteu-Reagenz bestimmt, wie von Boulton et al. beschrieben.^[27Es wurde eine Standardkurve für Gallussäure im Konzentrationsbereich von 0 bis 500 mg/L erstellt (^r²= 0,997). Die Ergebnisse werden als Gallussäure-Äquivalente (mg GAE/mL) angegeben.
125 μL destilliertes Wasser und 2850 μL FRAP-Lösung zu 25 μL Apfelsaft geben und die Mischung im Dunkeln stehen lassen für³⁰min. Anschließend wird die Absorption bei 593 nm mit einem Shimadzu UV-Spektrophotometer (UV-1601 PC) gemessen. Das FRAP-Reagenz wurde durch Mischen von 300 mM Acetatpuffer (pH 3,6), 20 mM Eisen(III)-chlorid und 10 mM 2,4,6-Tris(2-pyridyl)triazin (TPTZ) (gelöst in 40 mM HCl) im Verhältnis 10:1:1 hergestellt. Eine Standardkurve wurde unter Verwendung von Trolox als Standard erstellt (^R²= 0,999), und die Ergebnisse werden als μM Trolox/mL ausgedrückt.
Die antioxidative Aktivität der behandelten und unbehandelten Säfte wurde mittels der DPPH-Methode bestimmt, um ihre Fähigkeit zum Abfangen von DPPH-Radikalen zu bewerten.³¹Zehn Mikroliter Saft wurden mit 1 ml einer DPPH-Lösung (100 μM) in Methanol vermischt. Nach 30-minütiger Reaktion im Dunkeln wurde die Absorption der Mischung bei 517 nm mit einem Shimadzu UV-Spektrophotometer (UV-1601 PC) gemessen. Die Ergebnisse wurden anhand einer Kalibrierkurve als Trolox-Äquivalente (μM Trolox/ml) angegeben._^R2= 0,990).
Die gewonnenen Daten zeigten, dass die maximale Laccaseproduktion bei Austernpilzen der Sorte NRC 620 am Ende des 18. Fermentationstages mit einer Aktivität von 1302 U/L erreicht wurde. Dies diente als Grundlage für die Bestimmung der optimalen Kultivierungszeit für die Laccaseproduktion (Abbildung 1). Obwohl die Enzymproduktion mit zunehmender Kultivierungszeit anstieg, war die Zunahme nicht direkt proportional zur Kultivierungszeit; nach 21 Tagen war die Enzymaktivität nur um 90 U/L (auf 1390 U/L) gestiegen. Daher wurden letztendlich 18 Tage als optimale Kultivierungszeit gewählt, um ein ausgewogenes Verhältnis zwischen Produktausbeute und den wirtschaftlichen Vorteilen einer längeren Kultivierungszeit zu erzielen.
Einfluss der Kultivierungszeit auf die Laccaseausbeute in Pleurotus ostreatus NRC 620. Drei (12 mm) große Myzelblöcke des Pilzes wurden in 50 ml steriles Medium inokuliert und anschließend bei 28 °C für unterschiedliche Zeiträume kultiviert.
Unsere Ergebnisse deuten, übereinstimmend mit anderen Studien, darauf hin, dass die ideale Kulturdauer, um eine maximale Laccase-Sekretion durch Pilze zu erreichen, wahrscheinlich zwischen 7 und 36 Tagen liegt.³²Laut Ezike et al.³³*Trametes polyzona* WRF03 produzierte am Ende des neunten Fermentationstages die höchste Laccasemenge mit einer spezifischen Aktivität von 1637 U/mg Protein. Darüber hinaus berichteten Othman et al.³⁴Es wurde festgestellt, dass *Trichoderma harzianum* S7113 am fünften Kulturtag eine große Menge Laccase sezernierte. Die Laccaseproduktionsrate erreichte am vierzehnten Tag ihren Höhepunkt und nahm dann allmählich ab.³⁴Obwohl die Sekretion von Enzymen auch während der Hauptwachstumsphase erfolgen kann, erreicht sie ihren Höhepunkt üblicherweise in der Zwischenphase und wird durch den Verbrauch einer Kohlenstoff- oder Stickstoffquelle ausgelöst.^34,35
Obwohl die Laccase aus Pleurotus ostreatus NRC 620 über einen weiten Temperaturbereich von 50 °C bis 80 °C eine hohe Aktivität aufwies und nahezu ihren Höchstwert (69–98 %) erreichte, wurde ihre maximale Aktivität bei 70 °C beobachtet (Abb. 2a). Außerhalb dieses Temperaturbereichs nahm die Enzymaktivität bei etwa 70 °C ab. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass das Enzym bei hohen Temperaturen aktiv ist, vermutlich weil hohe Temperaturen die kinetische Energie der Reaktion erhöhen.
Einfluss der Reaktionstemperatur (a) und des pH-Werts (b) auf die Laccaseaktivität in *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Temperaturen von 20 bis 90 °C wurden durch 5-minütige Vorinkubation der Mischung bei verschiedenen Temperaturen vor Zugabe des Enzyms und Start der Reaktion erreicht. Der Einfluss des pH-Werts auf die Laccaseaktivität wurde mit ABTS als Substrat in Lösungen mit 0,1 M Citrat-Phosphat-Puffer im pH-Bereich von 2,5 bis 7,0 untersucht.
Laut Ezike et^al.33Die optimale Temperatur für die Laccase von *Trametes polyzona* WRF03 beträgt 55 °C und entspricht damit der Temperatur von *Ganoderma lucidum*.^laccase36und ähnlich der optimalen Temperatur (50 °C) für *Trametes polyzona* KU-RNW02737^Laccase . ^Baldrian38weist darauf hin, dass der ideale Temperaturbereich für Laccase, wie auch für andere ligninabbauende Enzymsysteme, zwischen 50 und 70 °C liegt.
Die Ergebnisse zeigten, dass das Enzym bei pH 3,0 die höchste Aktivität aufwies und bei pH 3,5 94 % erreichte. Es blieb jedoch über einen weiten pH-Bereich von 2,5 bis 7,0 aktiv (Abbildung 2b). Darüber hinaus zeigte es unter sauren Bedingungen eine höhere Aktivität als unter neutralen oder alkalischen Bedingungen. Seine Aktivität blieb im pH-Bereich von 2,5 bis 4,5 bei mindestens 77 %, erreichte aber bei pH 7,0 nur noch etwa 38 %. Das pH-Optimum für die Laccase aus *Trametes polyzona* WRF03 lag bei 4,533, was dem pH-Wert für Laccasen aus *Trametes polyzona* KU-RNW02737, *Trichoderma harzianum* 39, *Pleurotus* sp. 40 und *Trametes hirsuta* 41 entspricht. Laut der Studie von Chairin et al.⁴²Der optimale pH-Wert für Laccase aus *Polymorpha f. sp.* WR710-1 liegt bei 2,2, während der optimale pH-Wert für Laccase aus *Polymorpha f. sp.* IBL-04 bei 5,043 liegt. Die Bindung von Hydroxid-Anionen (Laccase-Inhibitoren) an die Kupferatome der T2/T3-Laccase könnte die Ursache für die verringerte Laccase-Aktivität unter neutralen oder alkalischen pH-Bedingungen sein. Dies könnte den internen Elektronentransfer vom T1-Zentrum zum T2/T3-Zentrum stören und dadurch die Aktivität der Laccase beeinträchtigen.^Begrenzungdie Enzymaktivität23,44
Durch Inkubation des Enzyms bei verschiedenen Temperaturen wurde festgestellt, dass sowohl die Inkubationszeit als auch die Temperatur die Enzymstabilität beeinflussen. Insbesondere zeigte die Laccase aus *Trametes polyzona* NRC 620 bei 40 °C und 50 °C eine höhere Stabilität und behielt nach 120 Minuten 68,33 % bzw. 59,61 % ihrer Ausgangsaktivität (Abbildung 3a). Im Gegensatz dazu behielt die Laccase aus *Trametes polyzona* WRF03 unter denselben Bedingungen (40 °C und 50 °C, 120 Minuten) 64,38 % bzw. 42,92 % ihrer Aktivität.³³Im Gegensatz dazu verringerten eine erhöhte Inkubationszeit und -temperatur die Stabilität der Laccase aus *Trametes polyzona* NRC 620. Nach 60-minütiger Inkubation bei 60 °C bzw. 70 °C sank ihre Aktivität auf 39,24 % bzw. 1,72 % (Abbildung 3a). Entsprechend den experimentellen Ergebnissen zeigte die Laccase aus *Trametes polyzona* WRF03 während des gesamten Wärmebehandlungsprozesses bei 40 und 50 °C eine höhere Stabilität.³³Ebenso Lueangjaroenkit et^al.37und Chairin et^al.42Die Stabilität von Laccasen aus Trametes polyzona KURNW027 und Trametes polyzona WR710-1 wurde bei 50 °C über einen Zeitraum von jeweils einer Stunde untersucht. Als nützlicher Biokatalysator für verschiedene biotechnologische Anwendungen sollte Laccase über einen breiten Temperaturbereich eine gute Stabilität und Aktivität aufweisen.
Thermostatische Stabilität (a) und pH-Stabilität (b) der Laccase aus *Pleurotus ostreatus* NRC 620. Die thermostatische Stabilität wurde durch Inkubation der Enzymlösung in 0,05 M Natriumphosphatpuffer (pH 7,0) bei 40, 50, 60 und 70 °C für jeweils 2 h bestimmt. Die pH-Stabilität wurde durch Inkubation der Enzymlösung in 0,1 M Citratpuffer und Tris-Puffer (pH 3, 4, 6 und 7) bei 40 °C für 2 h bestimmt. Die Restaktivität wurde nach der Inkubation mit ABTS als Substrat berechnet.
Um die optimalen Bedingungen für die Verwendung und Lagerung des Enzyms zu ermitteln, untersuchten wir den Einfluss des pH-Werts auf die Laccase-Stabilität. Unterschiedliche pH-Werte beeinflussten die Stabilität der Proteinstruktur signifikant und wirkten sich somit auf die Stabilität und Aktivität des Enzymmoleküls aus. Die Ergebnisse zeigten, dass das Enzym unter sauren Bedingungen weniger stabil war, während es bei höheren pH-Werten (neutraler und alkalischer Bereich) eine höhere Stabilität aufwies. Bei pH-Werten von 7,0, 6,0, 4,0 und 3,0 betrugen die Enzymretentionsraten nach 120 Minuten etwa 100 %, 62,54 %, 52,39 % bzw. 11,14 % (Abb. 3b). Die Laccase von *Strombus multisus* WRF03 zeigte eine höhere Stabilität bei neutralen pH-Werten (5,5–6,5) und eine geringere Stabilität bei sauren pH-Werten (unter 4,0). Nach 120 Minuten bei pH-Werten von 5,5, 6,0 und 6,5 betrugen die Enzymretentionsraten etwa 82 %, 100 % bzw. 93 %.³³Khairin et al.⁴²Sayed et al. stellten fest, dass die Laccase aus Trametes polyzona WR710-1 im pH-Bereich von 6,0 bis 7,0 stabil war.⁴⁵Die Ergebnisse zeigten, dass Laccase unter neutralen pH-Bedingungen stabiler ist. Laccase aus Cerrena unicolor wies jedoch auch unter alkalischen Bedingungen (pH 9,0) Stabilität auf.⁴⁶Die untersuchten Laccasen zeigten eine hohe Stabilität über einen weiten pH-Bereich. Dies könnte eine wichtige Eigenschaft für industrielle Anwendungen sein.
Da einige Metallionen sowohl stimulierende als auch hemmende Wirkungen auf die Enzymaktivität haben, müssen ihre Effekte bei industriellen Anwendungen berücksichtigt werden. Dies ist von entscheidender Bedeutung, da Metallionen häufige Umweltkontaminanten sind, die die Stabilität und Synthese extrazellulärer Enzyme beeinträchtigen können.⁴⁷Um die Auswirkungen verschiedener Metallionen auf die Laccase aus *Pleurotus ostreatus* NRC 620 zu untersuchen, führten wir entsprechende Experimente durch. Wie in Abbildung 4 dargestellt, beeinträchtigte eine Erhöhung der Metallionenkonzentration von 2,5 mM auf 10 mM – abhängig vom verwendeten Metall – die Enzymfunktion negativ. Zum Beispiel^Mg²⁺ , ^Co²⁺ , ^Zn²⁺, Und^Cu²⁺könnte die Enzymaktivität stimulieren und aktivieren,^Na⁺ , ^Mn²⁺ , ^Ca²⁺, Und^K⁺Die Enzymaktivität könnte gehemmt werden. Bei einer Konzentration von 10 mM waren Cu²⁺- und Mg²⁺-Ionen die stärksten Aktivatoren der Laccaseaktivität aus *Pleurotus ostreatus* NRC 620 und bewirkten einen Aktivierungsgrad von etwa 34 % bzw. 20 %. Ca²⁺-Ionen hingegen waren bei einer Konzentration von 10 mM der stärkste Inhibitor der Laccase und reduzierten die Enzymaktivität um etwa 60 %.
Der Einfluss von Metallionen auf die Aktivität der Laccase von Pleurotus ostreatus NRC 620 wurde untersucht. Die Laccase wurde 10 Minuten lang in Natriumphosphatpuffer (0,05 M, pH 7,0) mit verschiedenen Metallionen in Konzentrationen von 2,5 mM und 10 mM inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion durch Zugabe des Substrats (ABTS) gestartet und die relative Aktivität gemessen.
Unsere Ergebnisse stimmen mit denen anderer Autoren überein, die eine Steigerung der Aktivität von *Trametes polyzona* WRF03³ durch Mg²⁺ und Cu²⁺ beobachtet haben. Castaño et al.⁴⁸ fanden heraus, dass die Laccase aus *Xylaria* sp. durch Kupferionen (Cu²⁺) in gewissem Maße stimuliert wird. Darüber hinaus führten Foroutanfar et al.⁴⁹ und Si et al.⁵⁰ ähnliche Studien an Laccasen aus *Paraconiothyrium variabile* bzw. *Trametes pubescens* durch. Die Kupferbindungsstelle vom Typ II (T2) dieses Enzyms kann bei einer bestimmten Konzentration mit Cu²⁺ gesättigt werden, was die Stimulation der Laccaseaktivität bei höheren Cu²⁺³⁹-Konzentrationen erklären könnte. Da es sich bei den Laccasen von Weißfäulepilzen um Oxidasen handelt, die mehrere Kupferatome enthalten, sind die Auswirkungen von Kupferionen auf die Laccaseaktivität vielfältig und reichen von stimulierend und hemmend bis neutral.⁵¹ Im Gegensatz dazu zeigten Zhou et al.^[52]berichteten, dass^Cu²⁺Die Laccaseaktivität der taiwanesischen Untergrundtermite (Odontotermes formosanus) wurde gehemmt. Laccasen von Cerena sp. HYB07 hingegen…^[53]und Clitocybe maxima^[54]wurden durch Kupferionen nicht beeinflusst.
Die Substratspezifität wurde durch ihre kinetischen Parameter (Km und Vmax) dargestellt; je stärker die Bindungsaffinität des Substrats zum Enzym ist, desto niedriger ist der Km-Wert und desto höher ist die Substratspezifität.^3,21,55Die kinetischen Parameter (Km und Vmax) der Laccase aus *Pleurotus ostreatus* NRC 620 wurden mithilfe der Software GraphPad Prism 6.0 durch Erstellung eines Lineweaver-Burk-Diagramms bestimmt (Abbildung 5). Bei Verwendung von ABTS als Substrat ergaben sich Werte von 1,99 mM bzw. 16217 μmol.^{min⁻¹ L⁻¹,}Elsayed et al.²¹Es wurde berichtet, dass die Km-Werte für die ABTS-Oxidation 0,1 mM bzw. 0,064 mM betrugen, was auf eine hohe Affinität der Lac-A- und Lac-B-Isoenzyme zu ABTS hindeutet. Die Vmax-Werte lagen bei 0,182 μmol.^min⁻¹und 0,603 μmol^min⁻¹Der ermittelte Km-Wert war niedriger als der von Trametes polyzona WRF03 (8,66 mM); außerdem war deren Vmax-Wert (1429 mmol min⁻¹) ebenfalls niedriger.^unterebei Verwendung von ABTS als Substrat.33 In ähnlicher Weise betrugen die Km-Werte der Laccasekonzentrationen von Lentinus squarrosulus MR13 und Trametes sp. AH28-2 0,0714 mM bzw. 0,025 mM, und die Vmax-Werte lagen bei 0,0091 mM min−1 bzw. 0,67 mM min−1 mg−1 (relativ zu ABTS).^{, bzw.56,57}
Der Einfluss der ABTS-Konzentration auf die Aktivität der Laccase aus *Pleurotus ostreatus* NRC 620 wurde untersucht und ein Lineweaver-Burk-Diagramm der kürzesten Anfangsreaktionsgeschwindigkeit gegen die ABTS-Konzentration erstellt. Die Oxidationsreaktion von ABTS mit verschiedenen Laccase-Konzentrationen (0,025–3,0 mM) wurde bei pH 4,5 gemessen, um die kinetischen Parameter (V_max und K_m) zu bestimmen. Die Michaelis-Menten-Konstanten wurden anhand des Lineweaver-Burk-Diagramms der kürzesten Reaktionsgeschwindigkeit gegen die Substratkonzentration berechnet. Die Berechnung der kinetischen Konstanten erfolgte mit der Software GraphPad Prism 6.01.
Traditionelle Klärungsenzyme wie Pektinasen hydrolysieren Pektinstoffe und reduzieren so Viskosität und Trübung. Sie spalten effektiv Strukturpolysaccharide und werden häufig in Kombination mit anderen Enzymen wie Cellulasen und Hemicellulasen eingesetzt, um Ausbeute und Klarheit zu verbessern. Pektinasen wirken jedoch nicht spezifisch auf phenolische Verbindungen, die maßgeblich zur Trübung und oxidativen Bräunung beitragen, insbesondere in Säften wie Apfel- und Traubensaft.⁵⁸Im Gegensatz dazu katalysieren Laccasen die Oxidation phenolischer Verbindungen und polymerisieren diese zu größeren, unlöslichen Molekülen, die durch Sedimentation oder Filtration entfernt werden können. Dieser Mechanismus verbessert nicht nur die Klarheit, sondern verlängert auch die Haltbarkeit von Säften, indem er die Wahrscheinlichkeit einer oxidativen Bräunung durch phenolische Verbindungen verringert. Darüber hinaus können Laccase-basierte Klärungsprozesse unter milden Verarbeitungsbedingungen (pH-Wert 3,5–5,5, Temperatur 25–40 °C) durchgeführt werden, wodurch sie sich für empfindliche Säfte eignen, ohne deren Nährwert oder organoleptische Eigenschaften zu beeinträchtigen.⁵⁹Studien haben gezeigt, dass eine Pektinasebehandlung Saft innerhalb von 1–2 Stunden klären kann, während eine Laccasebehandlung typischerweise eine längere Reaktionszeit (3–6 Stunden) benötigt, um phenolische Verbindungen vollständig abzubauen. Dieser Prozess lässt sich jedoch optimieren, indem das Enzym immobilisiert oder die Laccasebehandlung mit mechanischen Klärungsverfahren kombiniert wird.⁶⁰In dieser Studie zeigte die Enzymprofilierung des Rohextrakts signifikante Laccase- und α-Amylase-Aktivitäten, während die Pektinase- und Xylanase-Aktivitäten extrem niedrig waren und Cellulase-Aktivität nicht nachweisbar war. Daher war die Reduktion der Trübung und des Phenolgehalts hauptsächlich auf die Wirkung der Laccase zurückzuführen, während die Viskositätsänderung teilweise durch die Wirkung der Amylase bedingt sein könnte.
Tabelle 1 zeigt die physikalisch-chemischen Parameter von frisch gepresstem Apfelsaft und mit Laccase behandelten Proben. Die Ergebnisse zeigen, dass die Ausbeute an frisch gepresstem Apfelsaft (71,59 %) geringer war als die der mit Laccase behandelten Proben (87,34 %). Diese Ergebnisse stimmen mit den Befunden von Pilnik und Orange überein.⁶¹Er wies darauf hin, dass der Einsatz von Enzymen bei der Fruchtverarbeitung die Saftausbeute steigern, die Filtration verbessern und einen qualitativ hochwertigen, klaren Saft für die Konzentration gewinnen kann. Die Steigerung der Saftausbeute ist hauptsächlich auf den erhöhten Gehalt an löslichen Zuckern im Saft zurückzuführen. Bei der enzymatischen Hydrolyse von Früchten werden Mesogloea und Pektin in den Zellwänden des Produkts abgebaut und in lösliche Substanzen wie neutrale Zucker und Säuren umgewandelt.^62.Der pH-Wert des mit Enzymen behandelten Apfelsafts war signifikant niedriger als der der Kontrollgruppe (P < 0,05), und der pH-Wert beider Gruppen stieg während der Lagerung signifikant an (Tabelle 1). Diese Ergebnisse stimmen mit denen von Mark et al. überein.⁶³Die Autoren stellten fest, dass der pH-Wert von Cashewsaft nach der Lagerung nach einer Wärmebehandlung sank. Der Pektinabbau und die Bildung von Galacturonsäure nach der Enzymbehandlung könnten für den pH-Anstieg während der Lagerung verantwortlich sein. Der pH-Wert der enzymbehandelten Proben blieb während der gesamten Lagerung zwischen 4,05 und 4,31, während der pH-Wert von unbehandeltem Apfelsaft zwischen 4,12 und 4,33 schwankte.
Der Gesamtsäuregehalt (TA) sowohl unbehandelter als auch mit Laccase behandelter Proben zeigte mit zunehmender Lagerzeit einen abnehmenden Trend (Tabelle 1). Die Abnahme des Säuregehalts wurde auf die Umwandlung organischer Säuren in Kohlenhydrate oder enzymatische Reaktionen sowie auf Oxidation während der Saftlagerung zurückgeführt.⁶⁴Der Gesamtsäuregehalt des Kontroll-Apfelsafts und der mit Enzymen behandelten Proben war niedriger als der anderer Säfte (Erdbeersaft 0,9 %, Pflaumensaft 2,2 %, Kumquatsaft 1,0 %, Aprikosensaft 2,4 %, Orangensaft 0,8 %), ähnelte aber dem anderer Säfte (z. B. Birnensaft 0,3 %).⁶²Diese Unterschiede bei unbehandeltem, frisch gepresstem Apfelsaft können auf verschiedene Faktoren wie Anbaubedingungen, genetische Faktoren, Reifegrad und Verarbeitungsmethoden zurückzuführen sein.⁶⁵Die Abnahme des Gesamtsäuregehalts von Kontroll- und Laccase-behandeltem Apfelsaft steht im Einklang mit den von Singh et al. präsentierten Ergebnissen.⁶⁶hinsichtlich der Abnahme des Gesamtsäuregehalts von Jin Nuo Apfelsaft nach 74 Tagen Lagerung. Andererseits stellten Oshmiansky und Wojdylo fest, dass…⁶⁷Bei der Untersuchung der Wirkung traditioneller Klärungsmethoden konnten keine signifikanten Veränderungen des Säuregehalts von Apfelsaft festgestellt werden.
Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der Gehalt an gesamten löslichen Feststoffen (TSS) im mit Laccase behandelten Apfelsaft höher war als in der unbehandelten Probe. Diese Ergebnisse stimmen mit veröffentlichten Studien überein.^{. 68}Des Weiteren zeigt Tabelle 1, dass der TSS-Wert der Kontrollgruppe (Apfelsaft) zu Beginn der Lagerung 9,58 betrug und bis zum Ende der Lagerungszeit 11,05 erreichte. Diese Werte liegen unter den von Hamid et al. berichteten TSS-Werten für frischen Apfelsaft.^{. 69}(11,2 bzw. 11,80). Der TSS-Wert der mit Laccase behandelten Apfelsaftproben stieg signifikant an, von 11,23 auf 12,93 nach zweiwöchiger Lagerung bei 4 °C (Tabelle 1). Ein ähnlicher Anstieg des TSS-Wertes während der Lagerung wurde auch bei Zitrusfrüchten, Zitronen und Orangen beobachtet. Der Anstieg des Gesamttrockensubstanzgehalts (TSS) während der Lagerung kann auf die Hydrolyse von Polysacchariden (Stärke) zu Monosacchariden (Zucker), die Konzentrationserhöhung durch Safttrocknung und den Abbau von Pektin im Saft zu löslichen Feststoffen zurückzuführen sein. Der Anstieg des Gesamttrockensubstanzgehalts (TSS) ist wahrscheinlich auf die Zunahme löslicher Zucker zurückzuführen, die durch die Umwandlung von Pektin oder Cellulose in lösliche Zucker durch Pektin bzw. Cellulase oder durch die Hydrolyse von Stärke zu Zuckern entstehen können, wie von Hamed et al. berichtet.^69.Die Wirkung von Laccase auf die Eigenschaften von Apfelsaft ist visuell erkennbar: Laccase-behandelter Apfelsaft weist eine bessere Fließfähigkeit und eine geringere Viskosität auf als unbehandelter Saft. Diese Beobachtung ist in Tabelle 1 dokumentiert; die Viskosität der enzymbehandelten Probe betrug 1,87 cP, die der Kontrollprobe hingegen 2,95 cP. Dieser signifikante Viskositätsabfall ist wahrscheinlich auf das höhere Wasserbindungsvermögen pektinartiger Substanzen und die Ausbildung einer kohäsiven Netzwerkstruktur zurückzuführen.
In dieser Studie wurde der Einfluss von Laccase auf den Bräunungsindex (BI) von Apfelsaft untersucht. Dazu wurde die Absorption bei 420 nm mit einem Spektralphotometer gemessen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. Während der Lagerung zeigte der BI der Apfelsaftproben sowohl in der behandelten als auch in der unbehandelten Gruppe einen allmählichen Anstieg. Der BI spiegelt den Grad der Bräunung wider und kann als … dienen.^{ein wichtiges}Indikator für enzymatische und nicht-enzymatische Bräunungsreaktionen. Die Absorption stieg während der Lagerung signifikant an (P < 0,05). Am Ende der Lagerung betrug die_A420Der Wert der Apfelsaftproben in der Kontrollgruppe und der enzymbehandelten Gruppe stieg um etwa 217 % bzw. 121 % (Tabelle 1). Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass die Enzymbehandlung den Bräunungsgrad effektiv um etwa 56 % reduzieren kann. Die Ergebnisse von Bezerra et al.^[19] stimmen mit unseren Ergebnissen überein; Sie verwendeten Laccase-Glutaraldehyd-Kokosfaser zur Klärung von Apfelsaft und reduzierten dessen ursprüngliche Farbe um 61%.
Obwohl Polyphenole in Fruchtsäften positive ernährungsphysiologische und therapeutische Wirkungen auf den menschlichen Körper haben, können sie auch mit Proteinen reagieren, was zu Trübungen, Ablagerungen oder einer Eintrübung des Saftes führt und dadurch den Geschmack und das Aroma des Produkts verändert sowie seine Haltbarkeit verkürzt.⁷¹Ziel dieser Studie war die sichere Reduzierung des Gehalts an phenolischen Verbindungen in Apfelsaft mithilfe von Laccase aus Pleurotus ostreatus NRC 620. Die in Tabelle 1 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass der Gesamtgehalt an phenolischen Verbindungen im mit Laccase behandelten Apfelsaft vor der Lagerung bei 4 °C signifikant reduziert war. Darüber hinaus sank der Gesamtgehalt an phenolischen Verbindungen während der Lagerung in beiden untersuchten Proben (Tabelle 1). (Forschung von Sandri et al.)⁷²zeigten, dass enzymbehandelter Apfelsaft seine antioxidative Aktivität und seinen Gehalt an phenolischen Verbindungen beibehalten kann. Die Ergebnisse einer Studie von Lettera et al.⁷³zeigen, dass die Behandlung von Orangensaft mit Pilzlaccase den Gehalt an phenolischen Verbindungen darin um bis zu 45% reduzieren kann.
Phenolische Verbindungen besitzen nachweislich Eigenschaften wie das Abfangen freier Radikale, die Reduktion und Löschung von Singulett-Sauerstoff, den Wasserstoffatomtransfer und die Elektronenabgabe an freie Radikale, was sie zu potenten Antioxidantien macht.⁷⁴Daher wurden in dieser Studie DPPH- und FRAP-basierte Methoden eingesetzt, um den Einfluss von Laccase auf die antioxidative Aktivität von Apfelsaft nach 14-tägiger Lagerung im Kühlschrank zu untersuchen (Tabelle 2). Beide Methoden zeigten einen Anstieg der antioxidativen Aktivität während der Lagerung. Dieser Anstieg könnte auf die Zunahme freier phenolischer Verbindungen oder die Bildung von Maillard-Reaktionsprodukten (MRPs) zurückzuführen sein, wobei die Maillard-Reaktionsprodukte wahrscheinlich die Ursache für den Anstieg der antioxidativen Aktivität sind.⁷⁵Nicht-enzymatische Bräunungsreaktionen (einschließlich Ascorbinsäureabbau, Maillard-Reaktionen und säurekatalysierter Zuckerabbau) erzeugen braune Pigmente (Melanoidine). Zwischenprodukte des Ascorbinsäureabbaus und des Zuckerabbaus (wie Carbonylverbindungen) können über Maillard-Reaktionen mit Aminosäuren reagieren.⁷⁶Obwohl die Bräunung von Obst und Gemüse während der Lagerung bereits umfassend untersucht wurde, ist unser Verständnis dieser Reaktionen nach wie vor begrenzt.⁷⁷Im Vergleich zur FRAP-Methode zeigte mit Laccase behandelter Apfelsaft eine signifikant geringere antioxidative Aktivität (DPPH-Methode, Tabelle 2). Die antioxidative Aktivität aller Proben stieg mit zunehmender Lagerdauer signifikant an. In dieser Studie wurden zwei verschiedene Methoden zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität angewendet, da sich deren Prinzipien unterscheiden. Die DPPH-Methode misst die Fähigkeit zur Neutralisierung freier Radikale, während die FRAP-Methode die Fähigkeit zur Reduktion von Eisenionen misst. Daher wird empfohlen, mehrere Methoden zur Bestimmung der antioxidativen Aktivität einzusetzen, um die antioxidative Aktivität der untersuchten Proben besser zu verstehen.⁷⁸
Eine der wichtigsten Erkenntnisse dieser Studie ist, dass die Laccase NRC 620 aus Pleurotus ostreatus ihre optimale Aktivität bei 70 °C und pH 3,0 aufweist. Im Vergleich zu anderen, häufig zur Saftklärung eingesetzten Pilzlaccasen, wie beispielsweise den Laccasen aus Trametes versicolor und Ganoderma lucidum, zeigt P. ostreatus NRC 620 eine höhere thermische Stabilität und einen saureren pH-Wert. Laccasen aus Trametes versicolor und Ganoderma lucidum weisen typischerweise eine optimale Aktivität im Bereich von 50–60 °C und bei pH-Werten zwischen 3,5 und 5,0 auf. Dieser Unterschied kann zu einer verbesserten Saftklärungseffizienz beitragen, insbesondere bei sauren Säften, bei denen die Stabilität bei niedrigeren pH-Werten entscheidend ist. Die einzigartige Eigenschaft von P. ostreatus NRC 620 ist seine Fähigkeit, auch unter anspruchsvolleren Bedingungen effektiv zu funktionieren. Die höhere optimale Aktivitätstemperatur deutet auf potenzielle Vorteile in industriellen Anwendungen hin, wie z. B. schnellere Reaktionsgeschwindigkeiten und geringere mikrobielle Kontamination. Der niedrige pH-Wert, der gut zum sauren Charakter vieler Säfte passt, könnte bei der Saftklärung von Nutzen sein. Diese Ergebnisse rechtfertigen weitere Untersuchungen für eine großtechnische Anwendung und machen *Pleurotus ostreatus* NRC 620 zu einer praktikablen Alternative zu herkömmlichen Pilzlaccasequellen. Im Vergleich zu früheren Studien fanden wir eine optimale Temperatur von 60 °C und einen optimalen pH-Wert von 3,0. Nach einer Reaktion bei 60 °C über 80 Minuten behielt die *Ganoderma lucidum*-Laccase ihre Aktivität.⁴⁶% seiner Aktivität.79 Laut Kurniawati und Nicelle⁸⁰Die Enzyme von Ganoderma lucidum weisen eine ausgezeichnete bis moderate Stabilität bei 25 °C und pH-Werten von 5,0 bis 8,0 sowie Stabilität bei pH 6,0 und Temperaturen von 10 bis 30 °C auf. In dieser Studie ermittelten wir für die Enzymaktivität von Pleurotus ostreatus einen pH-Wert von 3,0 und eine Temperatur von 70 °C. Nach zweistündiger Inkubation bei 40 °C bzw. 50 °C behielt das Enzym 68,33 % bzw. 59,61 % seiner Aktivität. Darüber hinaus zeigte die Laccase von Pleurotus ostreatus NRC 620 eine hohe Aktivität über einen weiten Temperaturbereich von 50 °C bis 80 °C und erreichte nahezu die maximale Aktivität (69–98 %), wobei die maximale Aktivität bei 70 °C beobachtet wurde.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die unter statischen Bedingungen gewonnene Austernpilz-Laccase NRC620 optimale Aktivität und Stabilität über einen weiten pH- und Temperaturbereich aufwies und damit eine höhere Stabilität als andere Enzymquellen zeigte. Die Zugabe von 10 mM MgSO₄ bzw. CuSO₄ erhöhte die Enzymaktivität um ca. 21 % bzw. 35 %. Bei der Verarbeitung zu Apfelsaft senkte das Enzym pH-Wert und Viskosität, während der Phenolgehalt während der Lagerung nur geringfügig abnahm.
Die Ergebnisse bestätigen das Potenzial von Laccase in der Lebensmittelindustrie, insbesondere bei der Getränkeklärung. Durch den gezielten Abbau phenolischer Verbindungen reduziert Laccase nicht nur die Trübung und verbessert die Klarheit, sondern erhält auch die Qualität von Fruchtsäften unter milden Bedingungen. Im Gegensatz zu herkömmlichen Klärmitteln wie Gelatine, Bentonit und Kieselgel erzeugt Laccase keine Abfälle und beeinträchtigt nicht die Aromen von Getränken. Dadurch ist sie eine umweltfreundlichere und nachhaltigere Alternative. Darüber hinaus bietet Laccase im Vergleich zu anderen Enzymen und Filtrationsmethoden eine gezielte und kostengünstige Lösung ohne Kompromisse bei der Produktqualität.
Kyomuhimbo, HD und Brink, HG. Anwendungen und Immobilisierungsstrategien von kupferhaltigen Laccasen; ein Überblick. Heliyon 9, e13156 (2023).